OSTEXOMAR® NTX Urine 試劑盒說明書（cat#9006）

酶聯免疫吸附法（EIA）定量檢測人尿液中I型膠原交聯氨基末端肽（NTX）

產品應用：

Osteomark 用于定量測定分泌的交聯型I型膠原N端肽（NTX）。NTX是骨吸收的一種標記物，尿液NTX水平的升高標志著骨吸收水平的升高。NTX的測量用于以下用途：

A．預測絕經后婦女用激素抗吸收治療的骨骼反應（骨密度）。

B．治療監測

1． 絕經后婦女的抗吸收治療

2． 診斷為骨質疏松癥人群的抗吸收治療

3． 診斷為佩吉特骨病人群（Paget’s Disease）的抗吸收治療

4． 雌激素治療監測

C．發現對于絕經婦女補鈣和激素治療一年后骨密度下降的可能性。

Osteomark 的檢測范圍是20~3000nM骨膠原當量（BCE）

實驗說明：

哺乳動物通過破骨細胞介導的骨吸收，伴隨由成骨細胞介導的骨形成的連續過程，而不斷的重建，這個過程對骨骼的正常發育和維持是必須的，這個緊密結合的過程的異常往往導致骨量和形狀的改變。對特異的骨降解產物的測定，可以作為研究骨代謝率提供分析數據。

約90%的骨組織基質是I型膠原，I型膠原是一種由C端和N端交聯的螺旋蛋白，這種蛋白組成了骨組織的基本結構和張力。NTX(交聯型I型膠原C末端肽)的發現為骨吸收提供了一種特異的生化標記物，這種標記物可用于免疫檢測。NTX作為骨檢測特性分子，是由于其氨基酸序列和a2端肽的結構方向。NTX分子的產生是由骨中破骨細胞介導的，作為一種穩定的降解終產物存在于尿液中。

OSTEXOMAR®試劑盒用于定量測定尿液中的NTX。尿液中NTX水平的升高標志著骨吸收水平的升高。骨吸收水平的升高是與年齡相關的骨量降低的首要原因。低骨量常常導致骨量減少，是骨質疏松的主要原因。當骨吸收水平高于骨形成水平時骨量降低。據報道，骨質疏松性骨折是老年婦女發病率和死亡率升高的主要原因。

對接受激素治療（HRT）和補鈣（500mg/ 天）或僅進行補鈣的絕經婦女進行了一次隨機、前瞻性的臨床試驗。試驗結果支持用Osteomark的試劑盒預測的反應和監測抗吸收治療的效果。

用OSTEXOMAR®試劑盒監測抗吸收治療的應用，在一項用雙磷酸鹽（alendronate sodium, 10 mg）治療骨質疏松病人的研究中得到了陳述。結果表明骨質疏松病人在經過三個月的治療后，其Osteomark值應被控制在≤35 NM BCE/mM肌酐或者經過3個月的治療后≥40%偏離于基線。

為了測定Osteomark試劑盒在監測佩吉特骨病人（Paget’s Disease）抗吸收治療效果的能力，進行了一項研究。Osteomark試劑盒基線值于治療開始后于基線的變化率都于血清堿性磷酸酶總量相關。在治療效果上，Osteomark試劑盒檢測值用于早期治療后的早期評估。抗吸收治療三個月后，佩吉特骨病人（Paget’s Disease）應偏離基值30%以上。

檢測原理：

OSTEXOMAR®試劑盒采用競爭法測定，用包被有NTX的微孔為固相，標本中的NTX和固相中的NTX競爭結合HRP標記的NTX單克隆抗體。結合到固相上的抗體的量和結合到標本中的NTX的抗體量成反比。標本中NTX的濃度通過吸光度發測定。通過標準曲線計算出。稀釋的尿液測定通過肌酐分析校正，用nMBCE/mmol 肌酐/L表示。

試劑盒組成：

試劑說明：

96孔板： 96孔（12x8）可拆板，包被有合成的NTX。

抗體：1瓶，純化的小鼠NTX單抗-HRP標記（含保護劑）。100X濃縮液（0.4ml）

抗體稀釋液：1瓶，用于抗體稀釋（含保護劑）30ml。

30X洗液：30x濃縮洗液。

顯色劑：100x濃縮液（0.9ml）

底物緩沖液：過氧化氫緩沖液 (30ml)

終止液：1瓶，1N硫酸（25ml）

標準品：分析用標準品：1,30,100,300,1000,3000nM BCE（各0.4ml）。

質控品：尿液質控品I，II，各一管。

試劑保存：

試劑2-8℃保存，用前置于室溫平衡。不要將試劑置于30℃或者2℃以下環境中，稀釋后的洗滌液可在室溫存放1個月。

試劑盒不提供的設備/試劑：

1） 移液器

2） 槍頭

3） 塑料容器

4） 自動洗板機

5） 酶標儀

6） 曲線擬合軟件

7） 去離子水

尿標本的收集保存：

1） 收集早晨的第二次晨尿或者24小時尿標本，盛于密閉容器中。

2） 尿標本中不要加保護劑

3） 帶血標本或溶血標本可能對測定造成影響，建議重新采集樣本。

4） 尿標本2-8℃可以保存72小時，室溫可保存24小時，冷凍（≤20℃）可長期保存，避免反復凍融。

5） 監測治療時，基準標本應該在治療開始前收集，后續收集的用于比較治療效果的標本收集的時間應與基準標本收集的時間一致。

注意事項

1） 僅供體外診斷用

2） 96孔板、標準品和尿液質控品匯總含有從人尿液或骨組織提取的抗原，應做適當處理。

3） 終止液中含有1N硫酸，不要濺到皮膚或眼睛中。一旦被濺到，立即用水沖洗15分鐘，濺如如眼睛時要立即就醫。

4） 顯色幾種含有TMB和DMSO。DMSO易被皮膚吸收，吸入、寄出皮膚或吞咽多會造成傷害，一旦暴露，應立即用流水沖洗暴露部位15 分鐘，如濺入眼中，立即就醫。

5） 尿液標本中可能含有傳染源，應做正確處理，用0.5%的次氯酸鈉溶液或121℃高壓消毒1小時。不要高壓次氯酸鈉的溶液，也不要將次氯酸鈉和酸混合。

6） 決不要用嘴吸試劑或臨床標本。

7） 處理標本和試劑時要穿防護衣，戴防護手套，用完后洗手。

8） 不要使用過效期試劑。

9） 不要將不同批號的試劑混合使用。

10）微孔板必須干燥保存，未使用的板條應當用盛有干燥劑的密封袋重新密封保存。

11）測定程序要在符合溫育要求的實驗環境中進行，測試中要避開特殊的環境條件。

操作流程：

1.    測定前至少將標本和試劑盒在室溫（18-28℃）平衡1小時。為了偏于加溫，將試劑從世紀合眾取出，冰凍狀態的尿標本，可用水浴或溫育箱37℃解凍后，置于室溫。顯色幾種含有DMSO,冷凍后是有可能是固體，室溫狀態下是液體。

2.    制備1X的洗滌液。將30X的洗滌液用去離子水1:30稀釋（1份30X濃縮洗滌液+29份去離子水）。至少混勻5分鐘，稀釋后的洗滌液在室溫可保存1個月 。

3.    做一個標準品、質控品和尿標本位置的孔排布圖。建議標準品、質控品和尿標本都做復孔，以下是測試4例樣本的排布圖。

4.    準備一個一次性塑料容器,用抗體稀釋液1:101稀釋濃縮抗體。對于整塊板，建議：

取20ul的抗體濃縮液用2ml的抗體稀釋液去稀釋，輕輕旋轉混勻，不要渦旋混勻或用磁力攪拌。配好的抗體稀釋液1小時使用，容器不要重復使用。

5.    測定前輕輕混勻標準品、質控品和尿液標本，不要形成泡沫。混濁樣本放置5-10分鐘再吸樣，含沉淀的尿標本，用前請離心。

6.    取出需要數量板條，剩余放回密封袋，沿拉鏈密封，保留干燥劑。

標本和抗體的孵育（測試開始后，不要間斷）

7．根據步驟3種的孔排布，加入25ul的標準品、質控品、尿液標本于相應的微量孔中。

  加樣槍用前校準，每次家養后需要換新的吸頭。

8.用排槍加入200ul的稀釋后的抗體，用封板膜封板，在平面上輕輕混勻5-10秒。

9.    室溫（18-28℃）孵育90±5分鐘。

10.  在溫育后的最后10min準備顯色底物溶液，將顯色液（Chromogen）加入底物緩沖液（Buffered Subsrate）中。建議，如果是整版的，去20ul顯色液加入到2ml的底物緩沖液中。底物緩沖液加到一個一次性塑料容器中，將顯色液充分混勻后加到底物溶液中，輕輕混勻，不要劇烈搖動或使用磁力攪拌。配置的顯色底物緩沖液要在30分鐘內使用。混勻后溶液應當是無色的，藍色表明試劑被污染，應當棄掉。配置顯色底物緩沖液的容器不可重復利用。

11.  溫育結束，小心揭去密封條，在自動洗板機上用洗液洗板5次，每次沖洗循環沒空最少350ul洗液。洗板過程中，每孔中應加滿洗滌液。沖洗結束，倒置板，在吸水紙上排干。立即加入上述配好的顯色底物緩沖液。

顯色和測定

12.  用排槍取200ul第10步配置好的顯色底物緩沖液加入到各孔。用封板膜封板。

13.  室溫孵育15±1分鐘，結合有HRP標記抗體的孔會有藍色顯色。

14.  孵育結束后，小心揭去封板膜。用排槍加入100ul終止液，孔內顏色由藍色變為黃色。

15.  在平面上將微孔板輕輕旋轉混勻5-10秒，室溫繁殖5分鐘后測吸光度值。

16.  加入終止液后30分鐘內，酶標儀讀取標準品、質控和樣本吸光度值。主波長450nm,副波長630nm，酶標儀應能保證最大OD≥3.0。

結果分析：

1.采用4參數曲線擬合的方式，做標準曲線計算樣本和質控的濃度值（nM BCE）。

2.結果在滿足以下條件下是有效的：

1）1nM BCE標準品的平均OD值必須≥1.5

2）1nM BCEE標準品OD值和3000NM BCE標準品OD值相差應≥1.3

3）樣本復孔間的變異系數（CV%）應≤20%。樣本，CV%≥20%的應該重測。

4)檢測值20 nM BCE(不包括肌酐調整值)

5）樣本濃度超過3000nM BCE需要用200-500nm BCE的尿樣做1:5稀釋后再測。當用樣本做稀釋液時，這個稀釋液的nm BCE也要在同一塊板上測定出來。稀釋倍數和背景（稀釋液的nm BCE值）也要合并計算。

例如：用測值是300nM BCE的尿液做稀釋液，以1:5的比例稀釋4000 nMBCE的樣本，測值為：1040nM BCE。

1040 nM BCE - (0.8 x 300 nM BCE) = 800 nM BCE

800 nM BCE x 5 (稀釋倍數) = 4000 nM BCE

注：1:5稀釋表示稀釋液（作為稀釋液的尿液中）的NTX 占20%

6） 檢測報告的測值用：nM BCE/ mM肌酐表示，例如：

測定值：360 nM BCE

尿肌酐值：60mg/dL肌酐/11.3（轉化因子）=5.3mM肌酐

360 nM BCE/5.3 mM肌酐=68 nM BCE/ mM肌酐

注：11.3(轉化因子)：將毫克/分升（dL）轉換為毫摩爾/L的轉化因子。

7.    廠家建立了自己的質控范圍，建議每個實驗室建立自己的質控范圍。

局限性：

雖然NTX被用作骨吸收檢測標記物，但尚未用于預測骨質疏松癥的形成和未來發生骨折的風險，也未用于診斷原發性甲狀旁腺機能亢進、甲狀腺甲狀腺機能亢進。當用該試劑盒監測治療效果時，可能會受到影響骨吸收的其他臨床條件的影響。例如：骨轉移。由于報告結果不包含時間因素，單一的Osteomark值不能提供骨吸收率。其結果應當結合臨床和其他診斷結果綜合分析。

干擾物質：

對尿液中各種可能對測定造成干擾的成份和微生物進行了評估。已檢測微生物，如：大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、白色假絲酵母菌（ATCC 14053）都對測定無干擾，人白蛋白、膽紅素、糖和維生素C對測定也無干擾。血尿標本和溶血標本可能對測定造成干擾，應棄掉，重新采樣。

預測值

表1：男性和絕經前婦女測值預期范圍

絕經前婦女的預期值范圍經對數轉換后為：14-74nM BCE/mM肌酐

男性參考范圍為：13-78nM BCE/mM肌酐

從對健康絕經后婦女（n=276,268）和30歲以上的男人（n=36,35）的研究中確立了短期和長期的變異。連續收集3-4天尿標本測定短期變異，連續收集2-3個月尿標本測定長期變異。短期變異：婦女15%， 男男子：18%。長期變異：婦女18%， 男性19%

重復性和精密度：

批內差異：由4個操作者分別對8份尿液標本重復測定10次而評估的。結果如下：

批間差異：由一個操作者對3分尿標本重復測定20次，進行評估，結果如下：

精密度：是通過30天中在3家臨床實驗室測定尿液質控品I和尿液質控品II進行評價的。尿液質控品I的均值為439 nM BCE，變異系數為10%，尿液質控品II的均值為1537 nM BCE，變異系數為7%。

抗原回收：

抗原回收是通過向3份已知NTX濃度的尿標本中加入已知量的NTX來評價。回收表示測得值占理論值（尿液基準值加新加入的抗原（NTX）值）的百分比，結果抗原回收率是105%。

線性檢測：

稀釋線性是通過對4分高nM BCE的尿液標本用200-500 nM BCE的尿液標本做系列稀釋來評價。結果顯示相關系數r=0.999 或 r=1.0000

注：中文譯文僅供參考，請以英文說明書為準